Western Blot中的三大常見問題

A：導致這種結果的因素很多。
    膠和膜放反了 如果在轉印的過程中，膠和膜的位置顛倒了，那么蛋白就從膠上轉移到緩沖液中，而不會到達膜上。對于標準的轉印，凝膠應靠近三明治的負極，而膜對應正極。
    轉膜效率低 轉膜效率受多種因素影響，包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉印時間和緩沖液的pH值。一般說來，蛋白越大，轉移得越慢。轉移大蛋白*好的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會穿出轉印膜。避免這個問題的方法是用0.2 um孔徑的NC膜或PVDF膜進行轉印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值，那么這個蛋白攜帶的電荷很少，在電場中也幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的，那么你可以用碳酸鹽（pH9.9）、CAPS（pH11）及酸性緩沖液。
    在轉印之后，你可以通過染膠或**塊膜來判斷轉印效率。為了幫助你直接監控轉印效率，Bio-Rad也提供了多種預染Marker，它們在電泳以及轉膜之后可直接觀察到。試劑放置太久或存放條件不正確 抗體會慢慢降解，如果反復凍融的話，它會快速降解。底物應儲存在-20°C。
    抗體不純或滴度太低 一抗的濃度差異很大，應該根據經驗來決定一抗的稀釋度。過猶不及，太多的抗體也會阻礙抗原與抗體的結合。一般的原則是以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養上清，以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超**動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000。
    酶失活了 疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要在HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結合的抗體中，而無副作用。另外，自來水或用聚苯乙烯樹脂去離子的水也可能會使酶失活，只能使用蒸餾的去離子水。
    使用Tween-20洗滌 Tween-20（吐溫-20）可能會干擾某些抗體-抗體相互作用，或洗走NC膜上的目的蛋白。盡管在洗滌時它的終濃度只有0.05%-0.1%，但仍可能會影響結合。因此除了封閉之后的**次洗滌，其他洗滌過程中都不使用Tween-20，不過，這可能會使背景升高。
    檢測系統缺乏足夠的靈敏度   確保蛋白的上樣量在檢測系統的靈敏度范圍內：
    辣根過氧化物酶                500 pg/band
    堿性磷酸酶                    100 pg/band
    增強的堿性磷酸酶              5 pg/band
    膠體金                        100 pg/band 
    增強的膠體金                  10 pg/band
    Immun-Star 化學發光           10 pg/band
Q：我的western blot總是背景過高，如何解決？

A：背景過高可能是由很多因素引起的：封閉不完全、顯色過度、洗滌不充分、轉移緩沖液或設備有污染、抗體稀釋度不對或抗體不純。

    封閉不完全 一抗或二抗只要結合到膜上，就會顯色。為了避免非特異性的結合，應用封閉液孵育膜，使所有的空白位點都被封閉蛋白占有。NC膜推薦的封閉液是3%的明膠。在室溫孵育1小時。明膠不能在4℃孵育，因為它會凝結。如果想要低溫封閉的話，可以用3%的BSA。PVDF膜推薦的封閉液是5%的脫脂奶粉。脫脂奶粉不能與Bio-Rad生物素化的蛋白標準一起使用。脫脂奶粉濃度過高也可能會產生背景。生物通 www.ebiotrade.com